RESUMEN
Estudios entomológicos en el foco de leishmaniosis del suroeste de la Comunidad de Madrid
La leishmaniosis está causada por protozoos flagelados del género Leishmania, distribuyéndose por zonas tropicales y subtropicales y afectando a 98 países en 5 continentes. Esta enfermedad puede afectar tanto a humanos como otros vertebrados, siendo un importante problema de salud pública en lugares de África, Asia, América Latina y sur de Europa. La leishmaniosis se engloba dentro de las enfermedades transmitidas por vectores, puesto que se transmite a través de la picadura de las hembras de flebotomos cuando se alimentan de la sangre de algún vertebrado. Además, es considerada una enfermedad tropical desatendida debido a su complejidad ecológica y epidemiológica, a la dificultad en el manejo de los casos, su mayor incidencia en la población más pobre de los países en desarrollo y a la falta de datos precisos sobre su extensión y distribución.
En España sólo está presente una especie del parásito, Leishmania infantum, y se distribuye por gran parte del territorio peninsular, afectando principalmente a las regiones mediterráneas, sur y central. A mediados del 2010 se detectó un aumento de los casos de leishmaniosis humana en la región suroeste de la Comunidad de Madrid, habiéndose notificado hasta la fecha más de 700 casos, que ha dado lugar al mayor brote de leishmaniosis humana en Europa. Esta región ha sufrido importantes cambios en su entorno debido la creación de dos grandes Parques Forestales limítrofes a municipios con una elevada densidad de población, que han propiciado el aumento de las poblaciones de conejos, liebres y también de flebotomos, y han favorecido la transmisión del parásito. El brote ha afectado principalmente a los residentes de Fuenlabrada, municipio donde se ha llegado a alcanzar una incidencia de 52,7 casos por cada 100.000 habitantes, y a otros tres municipios colindantes: Leganés, Getafe y Humanes de Madrid.
El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha sido la realización de un estudio exhaustivo del ciclo biológico de L. infantum en la zona, prestando especial atención a los aspectos entomológicos de la transmisión. Para ello, entre los años 2012-2014, se realizaron muestreos mensuales durante el periodo de actividad de los flebotomos, de junio a octubre, utilizando trampas adhesivas y trampas de luz tipo CDC. Las capturas se realizaron en 4 estaciones de muestreo, localizadas en Fuenlabrada y Leganés, durante dos noches consecutivas. De esta manera se ha llevado a cabo el estudio de la abundancia, distribución y dinámica estacional de las especies de flebotomos; y la determinación de las tasas de infección, la determinación de las cargas parasitarias y la identificación de las preferencias alimentarias en Phlebotomus perniciosus. Los resultados de los muestreos realizados muestran la presencia de cuatro especies de flebotomos: P. perniciosus, Sergentomyia minuta, Phlebotomus sergenti y Phlebotomus papatasi. La especie predominante es P. perniciosus, seguida de S. minuta.
Los resultados obtenidos revelan que la única especie de flebotomo implicada en la transmisión de L. infantum en el brote es P. perniciosus, cuyos elevados valores de densidad y abundancia relativa son indicativos de un riesgo de transmisión excepcionalmente alto.
Por otro lado, las fluctuaciones de cada especie a lo largo de los tres periodos de muestreo han sido diferentes. Mientras que P. perniciosus presenta predominantemente un patrón bimodal confluente, S. minuta muestra un modelo monomodal. Así mismo, la dinámica estacional de estas dos especies se ha visto influida por la temperatura y humedad relativa de la zona.
El estudio de las tasas de infección muestra valores elevados, tanto mediante disección de las hembras de P. perniciosus como mediante métodos moleculares. Además, la cuantificación de la carga parasitaria, mediante una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa optimizada en el laboratorio, ha permitido confirmar la presencia de elevadas cargas parasitarias en las hembras de P. perniciosus infectadas. Todos estos hallazgos ratifican la alta intensidad de transmisión de L. infantum en el brote.
Mediante técnicas moleculares se ha notificado por primera vez la presencia del tripanosoma del conejo, Trypanosoma nabiasi, en flebotomos. La detección de ADN de este parásito en hembras de P. perniciosus alimentadas de sangre de conejo capturadas en área del brote sugiere la posible implicación de estos dípteros en su transmisión.
El estudio de las preferencias alimentarias mediante la amplificación y la secuenciación de un fragmento conservado del gen de citocromo b (cytb) ha demostrado que las hembras de P. perniciosus se alimentan preferentemente de conejos y liebres, confirmando el importante papel que estos lagomorfos juegan en el ciclo de L. infantum en el área del brote. Además, se han encontrado hembras de esta especie alimentadas de gato, humano y perro; mientras que las hembras de S. minuta analizadas solamente presentaban sangre de salamanquesa. Por otro lado, se ha diseñado y optimizado una técnica de PCR seguida del estudio de los polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción del gen del cytb mediante la digestión de los productos amplificados con las enzimas de restricción HaeIII y HinfI. Los resultados demuestran que esta técnica, en la que se analizan los patrones de bandas diagnósticas obtenidos, es una opción funcional para la discriminación de las fuentes de alimentación en flebotomos, sirviendo de alternativa a técnicas más complejas y costosas económicamente como la secuenciación.
Como conclusión final, el trabajo llevado a cabo en la presente Tesis se muestra como el estudio entomológico más exhaustivo y completo realizado en el mayor brote de leishmaniosis registrado en Europa. La combinación de técnicas biológicas clásicas y moleculares ha demostrado ser una estrategia eficaz en la descripción de las características de las poblaciones de flebotomos presentes en la zona del brote, de sus fluctuaciones estacionales, de las tasas de infección y de las preferencias alimentarias.
SUMMARY
Entomological studies on the outbreak of leishmaniasis in the southwest of the Community of Madrid
Leishmaniasis is caused by flagellated protozoa of the genus Leishmania and is distributed in tropical and subtropical zones, affecting 98 countries on 5 continents. This disease can affect both humans and other vertebrates, and is a major public health problem in regions of Africa, Asia, Latin America and southern Europe. Leishmaniasis is a vector-borne disease, since it is transmitted through the bite of female sand flies when they feed on a vertebrate. In addition, it is considered a neglected tropical disease due to its ecological and epidemiological complexity, difficulty in case management, increased incidence in the poorest populations of developing countries and lack of accurate data on its extent and distribution.
Leishmania infantum is the only species of the parasite present in Spain and it is distributed over a large part of the peninsular territory, mainly affecting the Mediterranean, southern and central regions. In mid-2010, an increase in human leishmaniasis cases was detected in the southwestern region of the Community of Madrid with more than 700 cases reported to date, which has led to the largest outbreak of human leishmaniasis in Europe. This region has undergone important changes in its environment due to the creation of two large green areas, bordering municipalities with a high population density, promoting the increase in the population of rabbits, hares and also sand flies, which has favored the transmission of the parasite. The outbreak has mainly affected the residents of Fuenlabrada, where it has reached an incidence of 52.7 cases per 100,000 inhabitants, and three other neighbouring municipalities, Leganés, Getafe, and Humanes de Madrid.
The main objective of this Doctoral Thesis was to carry out an exhaustive study of the biological cycle of L. infantum in the area, paying special attention to the entomological aspects of transmission. To this end, between 2012 and 2014, monthly collections were conducted during the sand fly activity period―from June to October―using sticky traps and CDC-type light traps. The catches were taken in 4 sampling stations, located in Fuenlabrada and Leganés, during two consecutive nights. In this way, the study of the abundance, the distribution and the seasonal dynamics of sand fly species have been carried out in Phlebotomus perniciosus sand flies, as well as the determination of infection rates, the estimation of parasite loads and the identification of bloodmeal preferences.
The results of the surveys show the presence of four sand fly species: P. perniciosus, Sergentomyia minuta, Phlebotomus sergenti and Phlebotomus papatasi. The predominant species is P. perniciosus, followed by S. minuta. Thus, the results reveal that the only sand fly species involved in the transmission of L. infantum in the outbreak is P. perniciosus, whose high density and relative abundance values are indicative of an exceptionally high risk of transmission.
On the other hand, the fluctuations of each species over the three sampling periods have been different. While P. perniciosus has a predominantly bimodal confluent pattern, S. minuta shows a monomodal pattern. Likewise, the seasonal dynamics of these two species have been shown to be influenced by the temperature and relative humidity present in the area.
The study of infection rates shows high values both by dissection of P. perniciosus females and by molecular methods. In addition, the estimation of parasite loads by the optimized quantitative polymerase chain reaction has confirmed the presence of high parasite loads in the infected P. perniciosus females. All these findings confirm the high intensity of transmission of L. infantum in the outbreak.
The presence of rabbit trypanosome, Trypanosoma nabiasi, in sand flies has been reported for the first time using molecular techniques. DNA detection of this parasite in females of P. perniciosus fed on rabbit captured in the outbreak area suggests the possible involvement of these dipterans in its transmission.
Results on the study of bloodmeal preferences by amplification and sequencing of a conserved fragment of the cytochrome b (cytb) gene have shown that P. perniciosus females have fed primarily on rabbits and hares, confirming the important role that these lagomorphs play in the L. infantum cycle in the outbreak area. In addition, females of this species were found to be fed on cat, human and dog, while the tested S. minuta females presented only gecko blood. On the other hand, a PCR technique followed by the study of restriction fragments length polymorphisms of cytb gene has been designed and optimized by the digestion of amplified products with the restriction enzymes HaeIII and HinfI. The results show that this technique, in which the obtained diagnostic band patterns are analyzed, is a functional option for the discrimination of blood meal sources in sand flies, serving as an alternative to more complex and economically expensive techniques such as sequencing.
As a final conclusion, the work carried out in this Thesis is the most exhaustive and complete entomological study carried out in the largest outbreak of human leishmaniasis in Europe. The combination of classical and molecular techniques has proven to be an effective strategy for describing the populations of sand flies present in the outbreak area, their seasonal fluctuations, the infection rates and bloodmeal preferences.